| 出品公司: | 生物风 |
|---|---|
| 感受态细胞名称: | Rosetta-gami B(DE3) Ultracompetent cells；Rosetta-gami B(DE3) |
| 菌种类型: | E.coli |
| 产品规格: | 10X100 微升 |
| 转化效率: | 大于1X10的9次方 |
| 基因型: | F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB pRARE (CamR, KanR, TetR) |
| 抗性: | Cam，Kan，Tet |
| 质粒转化条件: | 42 ℃热激 |
| 生长条件: | 37 ℃, 有氧 |
| 用途: | 非毒性蛋白表达。 |
| 储存条件: | -80 ℃或者更低温度保存，避免反复冻融。 |
感受态细胞特点和简介
Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和 Rosetta四种菌株的优点：
＊ lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。
＊ pRARE赋予其Rosetta菌株的优点——补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。
＊ gor522::Tn10 trxB赋予其Origami菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。
＊ 该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)适合T7启动子诱导的蛋白表达。
＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那霉素，氯霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。
＊ lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其Tuner菌株的优点——IPTG以均一速度进入体系中大肠杆菌的每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。
＊ pRARE赋予其Rosetta菌株的优点——补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。
＊ gor522::Tn10 trxB赋予其Origami菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。
＊ 该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)适合T7启动子诱导的蛋白表达。
＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那霉素，氯霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。
感受态细胞制备方法
生物风在氯化钙感受态细胞制作方法的基础上进行了改良，采用最新的二价锰法感受态细胞制备方法，制备得到Rosetta-gami B(DE3)超级感受态细胞（Ultracompetent cell）。转化效率是常规氯化钙制备法的10倍。
感受态细胞操作方法
1. 取Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
注意：一次转化Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞为例。
2. 向Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞悬液中加入目的 DNA (100μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30 分钟。
3. 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
注意：此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
4. 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃摇床振荡培养45 分钟（150 rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或者LB 固体琼脂培养基平板上，用无菌的弯头玻棒涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被完全吸收后，倒置平板，37 ℃培养12-16 小时。
注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化质粒总量较多，可取更少转化产物涂布平板；反之，如转化的质粒总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板；对于连接产物的转化菌液，可以通过离心（4000 rpm，2分钟）后倒掉大部分培养液上清，吹打悬浮菌体后，将其涂布于一个平板中。
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新的培养平板。
感受态细胞注意事项
1. Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞应保存在-70 ℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2. 进行转化操作时，应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。
3. 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4. 用于转化的连接产物或质粒的体积不能超过感受态细胞体积的15%.
5. 质粒超过7.5 kb后，随尺寸的增加转化效率会下降，质粒的尺寸超过10 kb时，在大肠杆菌增殖过程中也可能会出现质粒缺失现象；
6. 用于转化的质粒量在0.1 pg~50 ng间的效果最好，超过50 ng质粒时，平板上单克隆数目会增加，但是转化效率会下降。
7. 42 ℃热击时间与离心管的厚度、菌液的体积、转入片段的大小直接相关，一般建议热击60-90秒，热击时间不宜超过90秒，否则转化效率会下降很快；
